Клеточный специфический иммунитет

Клеточный специфический иммунитет обеспечивается сенсибилизированными Т-лимфоцитами (Т-киллерами), а также некоторыми представителями О-лимфоцитов (NК-клетки, естественные клетки-киллеры). Т-лимфоциты (киллеры), реагируя с антигеном, выделяют лимфокины, обладающие цитотоксическим действием. Они нарушают проницаемость клеток-мишеней и вызывают их гибель. Кроме того, лимфокины повышают проницаемость капилляров, усиливают кровоток и способствуют развитию воспаления. Благодаря своим хемотаксическим свойствам лимфокины привлекают в очаг образующегося воспаления нейтрофилы, макрофаги и новое количество лимфоцитов, стимулируя функциональную активность этих клеток. Таким образом, цитотоксический эффект Т-лимфоцитов связан как с действием самих Т-киллеров, так и макрофагов (фагоцитоз).

Запомните Специфический клеточный иммунитет наибольшее значение имеет в формировании местных реакций замедленного типа (например при отторжении трансплантата или возникновении контактного дерматита), а также в осуществлении защиты организма при туберкулезе, опухолях, вирусных и грибковых заболеваниях.

Следует помнить, что у новорожденных специфический иммунитет обеспечивается только клеточной системой, и лишь через несколько месяцев у грудных детей появляются плазматические клетки и возможность формирования собственных иммуноглобулинов.

Отличительными особенностями Т-лимфоцитов являются: 1) их способность к так называемой бластной трансформации; 2) наличие на их мембранах рецепторов к эритроцитам барана; а также 3) рецепторов к FC-участкам иммуноглобулинов, причем Т-супрессоры имеют рецепторы к FC-фрагменту IgG и так называемые теофиллинчувствительные рецепторы, а Т-хелперы — только рецепторы к IgМ. Эти особенности легли в основу количественных методов оценки как всей популяции Т-лимфоцитов, так и отдельных субпопуляций (Т-хелперы, Т-супрессоры. Т-киллеры).

Методы исследования



Определение количества Т-лимфоцитов

Тест розеткообразования — классический метод определения количества Т-лимфоцитов в периферической крови — основан на наличии на мембране Т-лимфоцитов всех субпопуляций рецепторов к эритроцитам барана и способности Т-лимфоцитов образовывать с ними прочные комплексы (так называемые розетки) (рис. 1.111).

Рис. 1.111. Тест розеткообразования для определения числа Т-лимфоцитов. Схема

Кровь обследуемого пациента в количестве 10 мл вносят в пробирку с раствором гепарина и осторожно наслаивают на смесь фиколл-гипака, который способствует выделению лимфоцитов, и центрифугируют. После центрифугирования эритроциты оседают на дно пробирки, а лимфоциты располагаются тонким слоем на границе раствора фиколл-гипака и плазмы. Взвесь лимфоцитов осторожно извлекают из этого слоя (интерфазы), доводят до концентрации 2–4x10⁶/мл (2–4x10⁹/л) и смешивают с взвесью эритроцитов барана в соотношении 1:1.

Полученную смесь инкубируют при 37°С в течении 10 минут и снова центрифугируют, после чего выдерживают в холодильнике при температуре 4 °С в течение нескольких часов. Подсчет клеток производят в камере Горяева при люминесцентной микроскопии. Подсчитывают число “розеток” на 100 лимфоцитов и определяют процентное содержание Т-лимфоцитов. Для определения абсолютного количества Т-лимфоцитов в день исследования производят общий клинический анализ крови.

В норме содержание Т-лимфоцитов в периферической крови колеблется от 50 до 70% от общего количества лимфоцитов (в среднем 54,3±1,0%).

Определение активных Т-лимфоцитов

Активные Т-лимфоциты — это клетки, способные к спонтанному розеткообразованию без предварительной инкубации. Ход исследования тот же, что и при определении общего числа Т-лимфоцитов, за исключением этапа инкубации. В норме в периферической крови содержится от 23 до 40% активных Т-лимфоцитов (в среднем 34,6±1,9%).

Определение субпопуляций Т-лимфоцитов

Определение субпопуляций Т-лимфоцитов основано на выявлении так называемых теофиллинчувствительных и теофиллинрезистентных лимфоцитов. Клеточные мембраны Т-супрессоров, как было сказано выше, имеют рецепторы к теофиллину, который при взаимодействии с клеткой ингибирует реакцию спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана. Т-хелперы таких рецепторов не содержат, поэтому при взаимодействии с эритроцитами барана даже при добавлении теофиллина образуются “розетки”.

Методика количественного определения Т-супрессоров и Т-хелперов мало отличается от описанного выше теста розеткообразования, за исключением добавления в инкубационную среду раствора теофиллина. При этом Т-супрессоры (теофиллинчувствительные клетки) теряют способность розеткообразования с эритроцитами барана, а Т-хелперы (теофиллинрезистентные клетки) такую способность сохраняют (рис. 1.112).

Рис. 1.112. Тест розеткообразования для определения Т-супрессоров (а) и Т-хелперов (б). Схема

В норме соотношение Т-супрессоров и Т-хелперов составляет 1:3.

В последние годы для определения субпопуляций Т-лимфоцитов используют добавление к взвеси лимфоцитов моноклональных антител и комплемента, что приводит к лизису соответствующей фракции лимфоцитов. С помощью моноклональных антител можно выявить все известные субпопуляции Т-, В- и О-лимфоцитов, в том числе так называемые естественные клетки-киллеры.

Определение количества В-лимфоцитов

Методы определения количества В-лимфоцитов основаны на наличии на поверхности этих клеток специфических рецепторов к иммуноглобулинам и комплементу (С3). Наиболее простым способом количественной оценки В-лимфоцитов является модифицированный метод розеткообразования с эритроцитами барана (Е), нагруженными антителами (А) — иммуноглобулинами класса IgМ, в среде комплемента (С). Это так называемый тест ЕАС-розеткообразования. Для проведения теста, помимо реактивов, используемых для определения Т-лимфоцитов, необходима: 1) антисыворотка, содержащая антитела к эритроцитам барана (IgМ), которую получают путем иммунизации кролика эритроцитами барана, и 2) свежая сыворотка мышей, содержащая комплемент (рис. 1.113).

Рис. 1.113. Схема проведения теста ЕАС-розеткообразования для определения В-лимфоцитов. Объяснение в тексте

К эритроцитам барана добавляют антисыворотку иммунизированного кролика, содержащую антитела к эритроцитам (IgМ). При этом подбирается такая концентрация IgМ, которая не приводит к агглютинации эритроцитов и их гемолизу. К образовавшемуся комплексу ЕА (эритроциты-антитела) добавляют мышиную сыворотку, содержащую комплемент (С3), получая таким образом ЕАС-комплекс (эритроциты- антитела-комплемент).

Последующий ход реакции примерно тот же, что и при определении Т-лимфоцитов: выделенную взвесь исследуемых лимфоцитов смешивают с заранее приготовленной ЕАС-системой. Эритроциты барана с фиксированными на них IgМ и комплементом присоединяются к В-лимфоцитам, в результате чего образуются “розетки”. Подсчет количества “розеток” проводят в камере Горяева. При оценке результатов теста следует иметь в виду, что рецепторы к комплементу имеются на некоторых субпопуляциях Т-лимфоцитов, поэтому описанный метод дает лишь приблизительное представление о количестве В-лимфоцитов.

Более точные результаты можно получить при использовании метода иммунофлюоресценции с мембранными иммуноглобулинами. К исследуемым лимфоцитам добавляют антисыворотки против иммуноглобулинов человека, меченные флюорохромом. Лимфоциты, к рецепторам которых присоединяются соответствующие иммуноглобулины (IgM, IgG, IgА), можно легко обнаружить при микроскопии по характерной флюоресценции и провести подсчет как общего числа В-лимфоцитов, так и отдельных их субпопуляций.

В норме в периферической крови содержится 15–35% В-лимфоцитов (в среднем 25,0±1,2%).

Для характеристики состояния клеточного иммунитета важно оценить не только количество В- и Т-лимфоцитов и их субпопуляций, но и функциональное состояние иммунокомпетентных клеток. В клинической практике для этой цели используют в основном два теста: 1) реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) и 2) реакцию бластной трансформации лимфоцитов (БТЛ).

Реакция торможения миграции лейкоцитов

Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) позволяет охарактеризовать функцию Т-лимфоцитов. Реакция основана на свойстве коммитированных Т-лимфоцитов при контакте со специфическим антигеном выделять фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (лимфокины). В среде, в которую добавлен антиген, сенсибилизированные к нему лимфоциты снижают подвижность лейкоцитов: чем выше активность Т-лимфоцитов, связывающих специфический антиген, тем в большей степени тормозится процесс передвижения лейкоцитов в сторону данного антигена. Наоборот, если Т-лимфоциты не сенсибилизированы к данному (известному) антигену, реакции торможения не происходит.

Таким образом, РТМЛ позволяет выявить антиген (например специфический печеночный антиген и др.), к которому сенсибилизированы Т-лимфоциты и, следовательно, может быть использована в выявлении органоспецифической гиперчувствительности замедленного типа.

Лейкоциты крови, отмытые от сыворотки, смешивают с антигеном, к которому они сенсибилизированы. Лейкоцитарную взвесь набирают в капилляры, которые помещают в специальные камеры для инкубации (рис. 1.114). Контролем служат лейкоциты, не обработанные антигеном. В качестве антигена используют митогены растительного происхождения — фитогемагглютинин (ФГА) или конканавалин А (Кон А), а также органоспецифичные антигены (например специфический печеночный или почечный антиген, нативную ДНК и др.), аллергены, используемые для внутрикожных проб (туберкулин и др.).

Рис. 1.114. Схема проведения реакции торможения миграции лейкоцитов. Объяснение в тексте

В процессе инкубации лейкоциты перемещаются из конца капилляра. Площадь, которую они занимают, отражает степень торможения миграции лейкоцитов. Отношение площади миграции лимфоцитов в присутствии антигена (опыт) и без него (контроль) представляет собой индекс миграции. В норме он составляет 0,8–1,2. Снижение индекса миграции меньше 0,8 является показателем активного торможения.

Если в качестве антигенов использовать специфические клеточные структуры тех или иных внутренних органов (например мембраны кардиомиоцитов, печеночных липопротеидов, амилоидных фибрилл и т. п.), РТМЛ может оказаться полезной для подтверждения местной (органной) гиперчувствительности замедленного типа (например при неспецифическом миокардите, хроническом активном гепатите, амилоидозе почки и т. п.). При использовании бактериальных антигенов положительные результаты РТМЛ помогают решить вопрос об этиологии воспалительного инфекционного процесса. Наконец, результаты РТМЛ с неспецифическими ФГА и Кон А косвенно отражают общую функциональную активность Т-лимфоцитов.

В норме РТМЛ с ФГА составляют в среднем 40,5±1,8%, а с Кон А — 59,1±1,7%.



Реакция бластной трансформации лимфоцитов

Реакция бластной трансформации лимфоцитов (БТЛ) основана на способности сенсибилизированных Т- и В-лимфоцитов трансформироваться в культуре под действием неспецифических митогенов (фитогемагглютинина, конканавалина А и экстракта лаконоса) или специфических антигенов (грибковых, бактериальных, лекарственных и др.) в крупные малодифференцированные клетки типа бластов.

После инкубации 10 мл гепаринизированной крови отсасывают надосадочный слой плазмы, богатый лейкоцитами, разводят его питательной средой, разливают по флаконам, добавляют неспецифические митогены и специфические антигены и культивируют при температуре 37°С в течение 5–7 дней. После этого в окрашенном мазке подсчитывают число клеток-бластов и определяют их процентное содержание на 1000 клеток. Реакцию считают положительной, если количество бластов превышает 4%.

В последние годы для оценки результатов РБТЛ используют изотопный метод с ³Н-тимидином, который дает возможность определить общую активность культуры лимфоцитов.

Запомните Реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) используется: 1) для выявления органоспецифичности местных иммунных реакций замедленного типа (при использовании специфичных тканевых антигенов); 2) для подтверждения этиологии некоторых воспалительных инфекционных заболеваний (бактериальные, грибковые антигены); 3) для диагностики активности иммунного воспаления.

Другие методы исследования клеточного иммунитета (метод цветной проточной лазерной цитометрии, определение цитотоксического действия лимфоцитов и др.), хотя и отличаются высокой информативностью, не получили пока широкого распространения в клинической практике.

Г.Е. Ройтберг, А.В. Струтынский http://medbook.medicina.ru